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RIP實驗流程介紹
發布時間:2022-03-29 點擊次數:90次
  RIP技術主要是運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來,經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行q-PCR驗證或者測序分析。RIP是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術,是了解轉錄后調控網絡動態過程的有力工具,可以幫助我們發現miRNA的調節靶點。根據需求,金開瑞可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作驗證RIP技術服務。
 
  應用:
 
  1.用抗體或表位標記物捕獲細胞核內或細胞質中內源性的RNA結合蛋白;
 
  2.防止非特異性的RNA的結合;
 
  3.免疫沉淀把RNA結合蛋白及其結合的RNA一起分離出來;
 
  4.結合的RNA序列通過定量RT-PCR或高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定。
 
  RIP實驗流程:
 
  (一)細胞裂解液獲取
 
  A.單層細胞或者貼壁細胞處理
 
  1.冷PBS清洗培養皿或培養瓶中的細胞兩次
 
  2.加入冷PBS后用細胞刮將細胞刮下來,收集至enpendoff管
 
  3.1500rpm,4℃離心5min,棄上清,收集細胞
 
  4.用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞,吹打均勻后于冰上靜置5min
 
  5.每管分裝200ul細胞裂解液,貯存于-80℃
 
  B.懸浮細胞處理:先收集細胞再計數,然后清洗裂解
 
  C.組織樣品處理
 
  1.冷PBS清洗新鮮切下的組織三次
 
  2.加入冷PBS后,用勻漿器或其他細胞分離設備使組織分散為單個細胞,計數
 
  3.1500rpm,4℃離心5min,棄上清,收集細胞
 
  4.用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞,吹打均勻后置于冰上靜置5min
 
  5.每管分裝200ul細胞裂解液,貯存于-80℃
 
  (二)磁珠的準備
 
  A.實驗前準備
 
  1、enpendoff管
 
  2、磁力架
 
  3、冰盒,RIPWashBuffer置于冰上
 
  4、抗體,置于冰上
 
  5、渦旋震蕩器
 
  6、槍、槍頭放于超凈臺照射30min,槍噴DEPC水
 
  B.磁珠準備過程
 
  1.重懸磁珠
 
  2.標記實驗所需的enpendoff管,樣品包括目的樣品,陰性對照與陽性對照
 
  3.吸取50ul重懸后的磁珠懸液于每個enpendoff管
 
  4.每管加入500ulRIPWashBuffer,渦旋震蕩
 
  5.將enpendoff管置于磁力架上,并左右轉動15°使磁珠吸附成一條直線,去上清,重復一次
 
  6.用100ul的RIPWashBuffer重懸磁珠,加入約5ug相應抗體于每個樣品中
 
  7.室溫孵育30min
 
  8.將enpendoff管置于磁力架上,棄上清
 
  9.加入500ulRIPWashBuffer,渦旋震蕩后棄上清,重復一次
 
  10.加入500ulRIPWashBuffer,渦旋震蕩后置于冰上

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